更新日: 2020/3/31
今回は異物分析における差スペクトルの取り方の基本的な方法とコツについて書きます。異物が混合物で 1 つめの成分が判明している場合、残りの成分を定性するために差スペクトルを取ります。差スペクトルを効果的に活用するコツと、気を付けることをご紹介します。
差スペクトルとは
差スペクトルとは、混合物のスペクトルから既知のスペクトルを差し引くことで残りの成分のスペクトルを得るスペクトルの解析方法です。今回ご紹介する混合物の異物分析以外にも、例えば定量分析で溶媒などのマトリクスを差し引きたい場合や、温度変化などのスペクトルの変化を見たい場合等に使われます。
このように差スペクトルがスペクトル解析の様々な場面で使われますが、その一番の理由は理論的な背景が明確なことにあります。差スペクトルはランベルト・ベールの法則に基づいており、信頼される解析方法の一つです。
差を取るときは吸収スペクトルで
差スペクトルは吸収スペクトルで計算する必要があります。スペクトルの四則演算は吸収スペクトルに対しては成り立ちますが、透過スペクトルに対しては成り立ちません。ただし Spectrum IR ソフトウェアでは、仮に透過率表示で差スペクトルを取ったとしても、ソフトウェア内部で自動的に吸光度に変換して計算されますので、吸光度表示/透過率表示どちらの表示でも正しい結果が得られます。このエントリではスペクトルを吸光度表示で示します。
差スペクトルの取り方
さて、前回のエントリで異物 B を検索した結果、異物は混合物であり、1 つめの成分がパルプ、つまりセルロースとわかりました。今回、2 つめの成分を求めるために、混合物のスペクトルからパルプのリファレンススペクトルを差し引きます。混合物中のパルプの吸収強度とパルプのリファレンススペクトルの吸収強度は、ほとんどの場合同じではありません。そこで一般的にリファレンススペクトルに係数をかけて、差し引き具合を調節します。この係数を “ファクタ" とも呼びます。異物 B とパルプのリファレンスとの差スペクトルを図 1 に示します。ファクタは 0.4508 でした。
図1．異物 B とリファレンスの紙(パルプ)の差スペクトル
パルプのスペクトルが差し引かれて、混合物の残りの成分のスペクトルが得られました。
差スペクトルを取る時、ファクタをどのように決めるとよいのでしょうか？ ファクタは差し引き後のスペクトルを見ながら判断します。いくつかの判断の目安がありますが代表的なものを 2 つご紹介します。
① 負のピークが出ないようにファクタを決定する
② リファレンススペクトルのピークトップがベースライン付近に来るようにファクタを決定する
図2．ファクタの決め方のイメージ
図 2 にファクタの決め方のイメージを示します。元データはシミュレーション値です。元データの混合物（黒のスペクトル）は 2 つのピークを持っています。リファレンス（赤のスペクトル）は混合物のピークの 1 つとよく一致しています。ただし、リファレンスのピークトップは混合物のピークトップ位置より意図的に高波数側にシフトさせており、完全な引き算ができないようにしてあります。ずれ幅は、リファレンスピークの半値幅の 3 %（おおよそ 1 cm-1）です。リファレンススペクトルのピークトップ位置は赤の破線で示してあります。
さて、図 2 の①の方法ではリファレンススペクトルを引ききれず、差し引きが甘くなる場合があります。この場合、差スペクトルの検索結果が混合物の検索結果と似たようなものになり、2 成分目が求められません。
②の方法は①で上手く 2 成分目を求められない場合に採用します。負のピークが出ることがあります。図 1 の差スペクトルは②の方法でファクタを決めました。
①②どちらの場合も差スペクトルにリファレンススペクトルの残渣が残ることがあります。図 1 の差スペクトルには、3150 - 3050 cm-1、1040 - 920 cm-1 付近にセルロースの残渣があることがわかります。また 2300 - 1900 cm-1 に負のピークがありますが、これは ATR クリスタル（ダイヤモンド）による吸収の影響です。これらの残渣は検索結果に影響を与える可能性があります。
なぜきれいな差スペクトルが取れないの？
スペクトルの残渣は、引かれる側と引く側のスペクトルの形状のほんのわずかな違いで発生します。この違いは混合物中の物質間の相互作用や、測定時の温湿度などの環境差、測定装置間差、測定方法差測定条件差など様々な要因によって起きる可能性があります。
スペクトル形状のずれは、差スペクトルの残渣の大きさにどの程度影響を与えるのでしょうか。図 3 に、先ほどのシミュレーションスペクトルのずれ幅を振った時の差スペクトルを並べて示します。ずれ幅はリファレンススペクトルの半値幅（約 30 cm-1）に対して、0 %（ずれ無し）、1 %（0.3 cm-1）、3 %（1 cm-1）、5 %（1.5 cm-1）の 4 水準としました。
図3．ピークトップのずれ幅と差スペクトルの残渣の関係
ピークのずれ幅が 0 % なら差し引き後のスペクトルは平坦になります。ずれ幅が半値幅の 3 % になると、元データの異物スペクトルとリファレンススペクトルのピークの違いはほとんどわかりませんが、それらの差スペクトルからは明らかにリファレンスの残渣が見られます。ピークのずれ幅が大きくなると残渣も大きくなる傾向になります。
では差スペクトルがうまく取れず、リファレンススペクトルの残渣が強く残ってしまう場合、どのようにすればよいのでしょうか？
対応① 検索範囲を絞る
ひとつめの解決策は、該当する範囲を無視して検索するという方法です。Spectrum IR ソフトウェアのスペクトルの検索範囲を設定するオプションで、「検索に含めたい波数領域」と「検索に含めたくない波数領域」をいずれか、または両方設定することができます。
図4．スペクトルの検索領域の設定画面
検索範囲を適切に設定して検索した結果を図 5 に示します。グレーでハッチングした箇所は、検索対象から除外した範囲です。
図5．波数位置を絞って検索した結果（黒：差スペクトル 赤：検索結果 / 検索スコア 0.93）
トリメリテート系の可塑剤が検索結果の上位に表示されました。前回のエントリでも書いた通り、最終的なスペクトルの定性は波数位置の一致で判断します。この場合、検索対象の波数範囲の中で波数位置の一致を確認すると良いでしょう。
対応② リファレンスの測定条件を混合物とそろえる
ふたつ目の解決方法は、より良い差スペクトルを得るという方法です。リファレンスの残渣が強く残るケースの代表例が、市販ライブラリ内のリファレンススペクトルを使っている場合です。サンプルの置かれた状況や測定条件が大きく異なっていた場合、良好な差スペクトルは得られません。リファレンスサンプルを混合物の測定と同じ条件にそろえて新たに測定した方が良いでしょう。
異物分析であれば、リファレンスサンプルの候補となる物質は製造工程や異物が見つかるまでに製品がたどってきたルートのどこかにある可能性が高いはずです。異物分析と同時、あるいはその前に、候補となりうる物質を測定してユーザーデータベースに登録しておくことをおすすめします。既知物質を既知の方法で測定しているので結果の信頼性が大幅に高まり、結果的に解析にかける時間を短縮することができます。
（前回エントリで測定した異物A）をリファレンススペクトル (A)とし、異物 B と A の差スペクトルを取った結果を図 6 に示します。
図6．異物BとAの差スペクトル検索結果（黒：差スペクトル 赤：検索結果 / 検索スコア 0.95）
ベースラインの変動が小さく、良好な差スペクトルが得られていることがわかります。検索範囲は設定していないにもかかわらず、検索スコアが上昇しています、リファレンスの測定条件をそろえることで、差スペクトルと検索結果の合致度が高くなっていることがわかります。
このような方法で、第 3 成分、第 4 成分・・と、さらに混合物の解析を進めることもできます。
まとめ
差スペクトルは混合物を解析するための重要な解析方法ですが、リファレンススペクトルによっては上手く引ききれないことがあります。そういった場合の対応方法を 2 つご紹介しました。特に 2 つ目のユーザーライブラリを準備しておくことは特に大事です。また、近年は解析用 PC の計算能力も上がってきましたので、手軽に混合物を解析する方法として多成分検索が活用される例が増えてきました。多成分検索については別の機会に書きます。
次回はユーザーライブラリの登録・活用方法について書きます。どうぞお楽しみに！