TSA　免疫組織化学染色・in situ Hybridization増感システム Q & A

チラミドシグナル増幅法（TSA） は、PerkinElmer社が開発し特許を有するテクノロジーで、免疫組織化学染色(IHC)、in situ Hybridization (ISH)、電子顕微鏡での観察、ELISA法といったさまざまなアプリケーションにおいて、非常に強力にシグナルを増幅できる斬新な技術です｡ TSAでの増幅は発色検出・蛍光検出を問わずに行うことが可能であり、さらに、実験に使用する各種の検出用試薬の使用量を通常よりも減らすことができるため、バックグラウンドレベルを低減するという利点も兼ね備えています。また、IHC や ISHでの多重染色も TSA を使用すれば容易に行えます。TSAシステムの使用にあたっては、従来ご使用の標準的なプロトコールに TSAシグナル増幅のステップを付け加えるだけでかまいません｡

チラミドは TSA法において鍵になる物資です。チラミドはアミノ基をもつp-フェノール誘導体であり、過酸化水素存在下において西洋ワサビパーオキシダーゼ（Horseradish Peroxidase 、HRP）の触媒作用によりラジカル化される特性をもっています。このラジカルは近傍に豊富な電子をもつ芳香族化合物（チロシンやトリプトファンといったアミノ酸など）があるとき、それらと非特異的な共有結合を作ります。TSA法では、この性質を利用してシグナル増幅を行います。

チラミドを使用したシグナル増幅は、PerkinElmer社で特許を有するチラミド誘導体を使用した CARD (Catalyzed Reporter Deposition) 法に基づいて行われます。TSA法では、 HRP標識の一次・二次抗体やプローブを作用させた後に、少量の過酸化水素がある状態で、標識化チラミド体を作用させます｡ 過酸化水素は HRP の酸化作用により水酸化ラジカルに変移し、続いて水酸化ラジカルはチラミド分子の水酸基（-OH）の水素を得ることで安定化します｡ 一方、水素を失いラジカル化したチラミドは、通常他のラジカル化チラミドと互いの電子を共有して安定化しますが、近傍に豊富な電子をもつ芳香族化合物（サンプル組織中やブロッキング剤中のチロシン、トリプトファンといったアミノ酸など）が存在する場合、ラジカル化チラミド分子はそれらの芳香族分子と共有結合します｡ 通常、このようなラジカル化反応は 3-10分という短い時間に HRP の近傍でのみ生じるため、少数の HRP分子を中心として多数のチラミド分子が共有結合することで、劇的にシグナルの増幅が行われるのです。

TSA Plus DNP (HRP/AP) System には 2,4-dinitrophenyl (DNP) で標識を施したチラミド分子が含まれています。 DNPは Digoxigenin (DIG) 分子とよく似た小さな分子で、 自然界にはほとんど存在しません。 したがって抗DNP抗体は生体材料とは非特異結合を起こしにくいのです。 またキット名の "Plus" は、 キットに含まれるチラミド希釈液（Amplification Diluent） を反応に共存するHRPエンハンサーに至適化することで、 より高感度になっていることを意味します。

TSA増感システムを使用するためには、サンプルスライドが標準的な固定・包埋法で作成されたものであればかまいません｡ また、よく使用されているハプテン標識（Biotin、Fluorescein、DIG） はいずれも TSAシステムと互換性があるため、問題なく使用できます｡ ただし、実験プロトコールの中で HRP標識の抗体やプローブを作用させる行程があることが、TSAシステムを使用するにあたって要求されます。

TSAシステムは HRP の触媒作用によるシグナル増幅系です。したがって実験系の中に HRP標識を付加するステップが含まれている限り、何の問題もなく TSAシステムをご使用いただけます｡ 例えば Biotin標識の抗体やプローブを使用する系であれば、 HRP標識 Streptavidin を含む TSAシステムがご使用いただけます。 また、Fluorescein や DIG といったハプテン標識の抗体・プローブを使用する場合でも、HRP標識抗Fluorescein抗体（NEF710001EA）やHRP標識抗DIG抗体（NEF832001EA）を用意していただくことで TSAシステムを使用できるようになります。

TSAシステムを利用した IHC や ISH は、組織切片、培養細胞、植物組織、無脊椎動物の胚、などに応用され、良好な結果を残しています。

ホルマリン固定/パラフィン包埋の組織切片、パラホルムアルデヒド固定した培養細胞、凍結切片、メタクリル酸メチルなどの可塑性樹脂包埋したサンプルの切片などを使用した実験に利用され、良好な結果を得ています。

TSAシステムの方が、現在利用可能などのような検出システムよりも高感度です｡

たとえ TSAシステムを使用したとしても、結果を得るまでにかかる時間は標準的な IHC ・ ISH のプロトコルとほとんど変わりません。大抵の場合、シグナル増幅のステップには 3-10分程度しかかかりません。TSA Biotin System や TSA Plus DNP (AP/HRP) System の場合には、シグナル増幅ステップ以外に 30分ほど時間が必要ですが、チラミド分子に直接蛍光色素が結合している TSA Fluorescence System（Fluorescein/TMR/Cyanine 3/Cyanine 5） などでは、増幅操作の後、そのままシグナルを検出できますので、標準的なプロトコールよりも大幅に時間を節約できます。

TSAシステムを使用することで、解像度が目に見えて低下するというようなことはありません。もちろん必要であれば、試薬の使用量やシグナル増幅にかける時間を減らすことで、問題を改善することが可能です｡

一般に免疫組織化学染色や in situ Hybridization のバックグラウンドは、内在性の酵素や Biotin の発現レベルが高いため、二次抗体の非特異的な吸着、ブロッキング操作の欠如・洗浄操作が不十分/不適当であるといった技術的な理由など、さまざまな理由で生じます。TSAシステムの増幅試薬自体は、正しくタイトレーションをとって使用されているのであれば、バックグラウンドレベルを高めることはありません｡ しかしながら、チラミドを利用した増幅試薬は HRP の触媒作用で活性化されてしまうことから、内在性のパーオキシダーゼをあらかじめ失活させた上で、増幅操作を行うことが重要になります。キットに添付されるマニュアルには、内在性パーオキシダーゼを失活させる手順はもちろん、それ以外に問題になりうるバックグラウンドの解決法についても記載されています。また、バックグラウンドの原因やバックグラウンドを効果的に下げる方法を探すためにも、コントロールスライドの使用を強くお勧めします。
TSAシステムを使用することで、確実に S/N比は改善されます。実験系によっては、シグナルをより強く検出するために二次抗体濃度をやや高めに設定し、それがバックグラウンドを生じさせる一因となっていることがありますが、TSAシステムは強い増感作用を持つため、このような系に使用した場合には、抗体をより希釈した状態で使うことが可能になり、シグナルレベルを維持しながらバックグラウンドを低く抑えることが可能になることでしょう。

in situ PCR の代わりに TSAシステムを利用して、組織に感染したわずか1コピーのウィルスDNAを検出できるという報告がなされています。TSAシステムは in situ PCR にくらべて簡単に使用することができ、高価な専用の装置を必要とせず、実験系を組み上げるために必要なコントロールスライドの枚数も少なくてすみます。そしてより重要なことは、TSAシステムでの処理の方が、in situ PCR にくらべてはるかに再現性がよく、また処理後のサンプルの形状もしっかりと維持されているということです｡ さらに in situ PCR を使用した場合には、アーティファクトや増幅したシグナルの拡散などにより、False Positive が生じうるという問題を常にはらんでいます。以下は近年出版された論文（K. H. Wiedorn et al. 1999. Comparison of in situ hybridization, direct and indirect in situ PCR as well as tyramide signal amplification in the detection of HPV. Histochem. Cell Biol. 111:89-95） の一節ですのでご参照ください。 "We conclude that with regard to sensitivity, for many applications the use of ISH in combination with TSA is a good alternative to the cumbersome and often poorly reproducible in situ PCR due to the high signal amplification power of TSA. Concerning reproducibility and reliability the system based on in situ signal amplification by TSA is much better than that based on target amplification by indirect in situ PCR and, therefore, represents the technique of choice."

はい、現在までに免疫組織化学染色、in situ Hybridization の双方において、電子顕微鏡レベルでの TSAシステムを使用したシグナルの増幅に成功したという報告がなされています。

TSAシステムは、あらかじめ固定・染色した細胞をフローサイトメトリーで解析する場合には使用可能ですが、固定せずに生きた細胞をフローサイトメトリーで解析する場合には、現時点においてはご使用いただけません。

TSAシステムの各キットはスライド上の検体を対象にデザインおり、Western Blottingには使用できません。

TSAシステムの各キットはスライド上の検体を対象にデザインおり、ELISAには使用できません。TSAシステムと同様の原理を用いた ELISA のためのアプリケーションとして、PerkinElmer Life Sciences社ではマイクロプレートを使用した ELISA の発色を増強する試薬、 ELAST™ キット(ELISA Amplification SysTem) をご用意しています。ELASTキットは標準的な ELISA の発色検出プロトコールに容易に適用することができ、8-32倍程度のシグナル増幅が可能です。ELASTキットは標準的な ELISA の過程で、マイクロプレート上でHRP標識抗体を作用させた後に Biotin標識チラミドを含む増幅試薬を作用させ、続いて HRP標識 Streptavidin を付加し、最後に OPD や TMB を発色基質としてシグナルの検出を行います。ELASTキット（製品コード番号：NEP116） は 96well マイクロプレート 10枚分の試薬が含まれており、コンポーネントとして Biotin標識チラミド(Amplification Reagent)・ 2x チラミド希釈液(Amplification Diluent)・HRP 標識 Streptavidin が含まれています。

TSAシステムを利用し、連続的に複数の標的分子に対して、多重染色を行うことができます。免疫組織化学染色においては、異なる生物種由来の一次抗体を使用する場合はもちろん、同一種由来の一次抗体を使用する場合でも、TSAシステムを使用して多重染色に成功したという報告が行われています。また in situ Hybridization では、RI プローブと Non-RI プローブ＋発色検出、ともに Non-RI プローブを使用し異なる発色で検出したもの、2種以上の Non-RI プローブを使用し、それぞれを異なる蛍光で検出したものなど、様々な組み合わせでの成功が報告されています。また TSAシステムを使用し、たんぱく質の検出(IHC) と核酸の検出(ISH)とを同一のサンプルに対して行うことも可能です。

TSA System（Biotin、Fluorescein、TMR、Coumarin、Cyanine 3、Cyanine 5）： 各種ハプテン標識チラミド（Amplification Reagent）、１x チラミド希釈液（Amplification Diluent）、ブロッキング試薬、HRP 標識 Streptavidin
TSA Plus DNP (HRP/AP) System： DNP 標識チラミド（Amplification Reagent）、１x チラミド希釈液（Plus Amplification Diluent）、ブロッキング試薬、HRP/AP標識抗DNP抗体
TSA Plus Fluorophore System（Fluorescein、TMR、Cyanine 3、Cyanine 5）： 各種ハプテン標識チラミド（Amplification Reagent）、１x チラミド希釈液（Plus Amplification Diluent）

TSAシステムにはさまざまなサイズのパッケージをご用意しています。染色可能なスライド数は、目的の組織切片、あるいは細胞を完全に覆うために要する液量によって左右されます。パッケージとして表示されているキットあたりのスライド数は、ハプテン標識チラミド液（Amplification Reagent） の使用量をスライド １枚あたり 100-300µL とした場合です｡

現在販売している TSAシステムでは、どのキットでも免疫組織化学染色と in situ Hybridization の双方での使用できるようになっています。したがって、残念ながらそれぞれのための専用キットというものはございません。

蛍光色素	Excitation	Emission
Fluorescein	494nm	517nm
Tetramethyl-rhodamine (TMR)	550nm	570nm
Coumarin	402nm	443nm
Cyanine 3	550nm	570nm
Cyanine 5	648nm	667nm
Texas Red™	593nm	612nm

TSAシステムでは、 DAB・ AEC・ BCIP/NBT・ Fast Red など、標準的に使用されているあらゆる種類の発色基質を使用することができます。

パラフィン包埋切片中のたんぱく質の抗原性を回復する方法としては、しばしばサンプルスライドをボイルしたり電子レンジで熱を加えたりする方法が用いられます。しかしながら、TSA増感システムのもつシグナル増幅効果は非常に強いため、TSAシステムを使用すれば、抗原性を回復する処置を行わなくても目的のシグナルを検出できるかもしれません。もちろん、抗原性の回復と TSAシステムの利用とを組み合わせることにより、初めて目的のシグナルを検出できるようになる可能性もあります。

コントロールスライドでの実験は、実験結果を科学的に検証するために非常に重要であり、常に行われなければなりません。また、コントロールスライドはサンプルのシグナルが非特異的なものか否かを判定する材料としても有用です。そのためにも、 TSAシステムでの増幅を行っていないコントロールスライド、ならびに増幅を行ったネガティブコントロールスライドを用いた実験を常に行うことをお勧めします。免疫組織化学染色(IHC) の場合、非増幅コントロールでは特異的一次抗体を含め、TSAシステム以外の全ての試薬を使用して、増幅済ネガティブコントロールでは一次抗体を使わずに、もしくは非特異的抗体を使って Hybridization を行い、TSAシステムを含めて全ての試薬を使用した実験を行う必要があります。in situ Hybridization (ISH) の場合、非増幅コントロールでは特異的プローブを含め、 TSAシステム以外の全ての試薬を使用して、増幅済ネガティブコントロールではプローブを使わずに、もしくは非特異的なプローブを使って Hybridization を行い、TSAシステムを含めて全ての試薬を使用した実験を行う必要があります。

キットの中に含まれる Blocking Reagent や、単品販売している Blocking reagent(FP1020) は、弊社において製造時にパフォーマンスを確認しています｡ もちろん、血清や BSA、カゼインなどが代替品として使用可能であることが、文献上に記載されています。どのようなものが大体試薬として使用可能かについてはそれぞれのケースで確かめていただく必要があります。

TSA Plus DNP (HRP/AP) System (NEL746A, 746B, 747A, 747B) の利用をお勧めします。このキットは Biotin を使用しないため、内在性の Biotin レベルの高いサンプルには最適です。

ハプテン標識チラミド（Amplification Reagent・jの活性化・共有結合は HRP の触媒作用による現象です。したがってバックグラウンドレベルを最小限に抑えるためには、TSAシステムの増幅試薬をサンプルへ添加する前に、内在性のパーオキシダーゼを失活させる必要があります。失活させるためには、メタノールあるいは PBS で 0.3-3% の濃度に希釈した過酸化水素水（H2O2） で 10-60分間ほどの失活処理を行うとよいでしょう。パラフィン包埋組織切片の場合、ワックスの除去やアルコールによる再水和の処理を行った後、そしてプロテアーゼ処理を行う前にパーオキシダーゼの失活処理を行う必要があります。また凍結切片の場合は、サンプルの固定の後・プロテアーゼ処理の前に失活処理を行ってください。サンプルごとにパーオキシダーゼ失活処理の条件を至適化する必要があるのはいうまでもありません。

自己蛍光は可視光の波長域における問題であり、赤外域に近い蛍光を発する蛍光を使用すれば、自己蛍光の問題は回避される可能性があります。したがって TSA Cyanine 5 System・ TSA Plus Cyanine 5 System のご使用をお勧めします。

Cyanine 5 は赤外域に近い長波長の蛍光を発する蛍光色素です (Excitation 648nm/ Emission 667nm)。したがってこの条件に基づいて蛍光顕微鏡のフィルタ類を入れ替える必要があるでしょう。加えて、Cyanine 5 の可視化には CCDカメラを装備した蛍光顕微鏡（冷却機能の有無・共焦点か否かは問いません）が必要になります。

TSAシステムの各キットは冷蔵品として輸送されます。製品の到着後は 4℃ で保存してください｡ハプテン標識チラミド（Amplification Reagent） は乾燥した状態で供給されるため、容器のチラミドは目では見えません。チラミドを使用する際には、キットのマニュアルに従い規定量の DMSO（dimethyl sulfoxide, Molecular Biology Grade あるいは HPLC Grade）、あるいはCyanineのみDDWにて溶解します。溶解したチラミドを保存する場合は、4℃にて保存します。なお、DMSOはできるだけフレッシュなもの（DMSO は 4℃ で凍りますが、経時変化により加水分解した DMSO は 4℃では凍りません） を使用してください｡分解した DMSO の使用はトラブルの原因になります。

ビオチンおよび各種の蛍光色素を標識したチラミド（Tyramide Reagent Pack） を購入していただくことができます。各パッケージには、 １x ハプテン標識チラミド(Amplification Reagent) とチラミド希釈液(Amplification Diluent) が含まれています（プロトコールは含まれておりません）。したがって、他に必要な各種試薬類は別途準備していただく必要があります。初めて TSAシステムを使用する場合には、キットに含まれている試薬類はあらかじめ至適化されており、また TSAシステムを使用するために必要なプロトコールが添付されていることから、まずは TSA System のキットを選択することを強くお勧めします。Tyramide Reagent Pack に関して、詳しくは直接お問い合わせ下さい。