Take Aim at the Perfect Target

Gタンパク質共役型受容体（GPCR）は、細胞表面に存在する最大の受容体ファミリーであり、最も精力的に研究されている創薬標的の一つであるため、科学者から大きな期待が寄せられています。実際、GPCR を標的とした治療法には、あらゆる薬理学的分類のリガンド（アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、アロステリックモジュレーター）が含まれており、主要な器官の疾患や、心血管疾患、中枢神経系疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、腫瘍、希少疾患などの治療分野で使用されています。さらに、細胞表面に位置することで、多くの薬物分子がアクセスすることができます。

創薬における GPCR の重要性とはー市販されている治療薬の 3分の1 は、GPCR に結合して作用すると言われています。

パーキンエルマーは、GPCR 研究の重要性を認識しており、今日の最も有望な創薬ターゲットに関する研究のあらゆる側面に対応する装置、試薬、ツール、技術を提供しています。

Gs, Gi, and Gq Signaling

Gタンパク質は、Gi、Gs、Gq に分類され、それぞれ異なる経路でシグナルを発します。Gq タンパク質はホスホリパーゼC（PLC）酵素に依存し、Gs および Gi タンパク質はアデニル酸シクラーゼ（AC）を刺激・阻害し、細胞質の cyclic AMP（cAMP）の発現量に作用します。

GPCR シグナル伝達系では、最適なアッセイ条件は、GPCR 共役の有効性や、研究対象となる化合物や使用する細胞株の薬理学的特性によって異なります。

イノシトールリン酸の代謝カスケードは、多くの場合、ヘテロ三量体 G タンパク質の Gαq サブユニットに関連する PLC-β の制御に起因します。イノシトール三リン酸(IP3) の代用として、D-myo-イノシトール一リン酸（IP1）などの重要なメディエーターを測定することができます。Gαq と結合した GPCR は、PLC-β の活性を刺激し、その結果、細胞内の IP1 が増加します。

cAMP は、最も重要な GPCR の細胞内メディエーターの一つであり、多くの場合、ヘテロ三量体 G タンパク質の Gα サブユニットによるアデニル酸シクラーゼ(AC)の制御に起因します。 Gαs 結合型 GPCR は、AC の活性を刺激し、細胞内 cAMP の増加をもたらす。Gαi 結合型 GPCR は、AC を負に制御し、cAMP の産生を減少させます。

G-Protein Signaling – Gs, Gi, and GQ are types of G-protein α subunits.

GTPγS – GTP Binding Assay

グアニン5′（三水素二リン酸）（GTPγS）は、GTP の非加水分解性アナログであり、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を刺激するなど、同様の生理的挙動を示します。

GTP 結合アッセイは、G タンパク質 α サブユニットへの GTP の結合を測定することにより、GPCR のアゴニスト占有後の G タンパク質活性化レベルを測定します。このアッセイによって、受容体が媒介する最初のイベントの一つである、受容体占有機能をファンクショナルに測定します。

このシンプルなアッセイにより、シグナル伝達における各々のタンパク質の役割、GPCR-受容体の構成的活性変化、アゴニスト特異的シグナル伝達など、現代の薬理学上の課題をより深く理解することができます。

β-Arrestin Signaling

アレスチンは、GPCR のシグナル伝達を制御するタンパク質ファミリーです。
β-アレスチンは、GPCR の脱感作、内在化と隔離、トラフィッキングなど、多くの生理的・病理的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。

β-アレスリン1 と β-アレスリン2 は、GPCR の脱感作と内在化を媒介し、様々な組織や細胞に広く分布しています。両者ともに細胞質に集積しますが、β-アレスリン1は核にも集積します。

これらのタンパク質は、足場タンパク質として機能し、MAPK 伝達経路の特定のタンパク質や、ERK や AKT などの様々な GPCR の下流のターゲットと関連しています。

β-アレスリンは、広範囲のGタンパク質シグナルを阻害し、より直接的なシグナル伝達カスケードを活性化する能力があるため、通常のGPCRを標的とした薬剤よりも副作用の影響を受けにくい治療法を開発することが可能と言われています。

β-arrestin-regulated internalization of GPCR

(1) Biased ligands open the internal segment of GPCR to phosphorylation. (2) β-arrestin is recruited in place of G proteins. (3) β-Arrestin recruit AP2 (adaptor complex) which acts as a linker for clathrin to the GPCR. (4) Clathrin and dynamin networks coat and define an internalization area around the GPCR. (5) The GPCR is internalized and the internalization complexes disassemble.

Receptor Binding

非放射性 Tag-lite バインディングアッセイは、化合物の化学構造や薬理特性に関わらず、化合物の結合特性を評価するための簡単な「まぜるだけ」の手法です。

18 種類の Tag-lite バインディングアッセイがバリデーションされており、カスタムアッセイ構築・開発サービスもパーキンエルマーでは提供いたします。

Kd を測定するには、蛍光リガンドを一定数の標識細胞を含む溶液に滴定し、平衡状態になるまでインキュベートします。Ki を測定するには、化合物を一定濃度の蛍光リガンドと一定量の細胞を含む溶液に滴定します。平衡状態では、受容体に結合した標識リガンドの割合は、記録された FRET シグナルに比例します。結合親和性は、この結果得られたシグナルから計算されます。

Phosphorylation Pathways

GPCR が活性化されると、まず G タンパク質を介してシグナルが伝達され、次にセカンドメッセンジャーが伝達される。そのシグナル伝達の第3 の部分には、転写因子や遺伝子発現の変化につながるリン酸化タンパク質パスウェイが関与しています。

すべての GPCR はそれぞれ特異的なシグナル伝達パスウェイを持ちますが、リン酸化酵素はそのパスウェイに常に関与しており、核に至るまでのリン酸化カスケードのトリガーやプロモーターの役割を果たしています。MA キナーゼパスウェイは 3種類の GPCR に共通しており、結果として、細胞の生存、増殖、分化、代謝における、GPCR の活動をモニタリングすることができます。

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