GPCRs: The Pathway To Discovery - PerkinElmer Japan

Complete Solutions for Drug Discovery

Take Aim at the Perfect Target

Gタンパク質共役型受容体(GPCR)は、細胞表面に存在する最大の受容体ファミリーであり、最も精力的に研究されている創薬標的の一つであるため、科学者から大きな期待が寄せられています。実際、GPCR を標的とした治療法には、あらゆる薬理学的分類のリガンド(アゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニスト、アロステリックモジュレーター)が含まれており、主要な器官の疾患や、心血管疾患、中枢神経系疾患、呼吸器疾患、代謝性疾患、腫瘍、希少疾患などの治療分野で使用されています。さらに、細胞表面に位置することで、多くの薬物分子がアクセスすることができます。

創薬における GPCR の重要性とはー市販されている治療薬の 3分の1 は、GPCR に結合して作用すると言われています。

パーキンエルマーは、GPCR 研究の重要性を認識しており、今日の最も有望な創薬ターゲットに関する研究のあらゆる側面に対応する装置、試薬、ツール、技術を提供しています。

eBook: Understainding GPCRs

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Guide: Pharmacology

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Gs, Gi, and Gq Signaling

Gタンパク質は、Gi、Gs、Gq に分類され、それぞれ異なる経路でシグナルを発します。Gq タンパク質はホスホリパーゼC(PLC)酵素に依存し、Gs および Gi タンパク質はアデニル酸シクラーゼ(AC)を刺激・阻害し、細胞質の cyclic AMP(cAMP)の発現量に作用します。

GPCR シグナル伝達系では、最適なアッセイ条件は、GPCR 共役の有効性や、研究対象となる化合物や使用する細胞株の薬理学的特性によって異なります。

イノシトールリン酸の代謝カスケードは、多くの場合、ヘテロ三量体 G タンパク質の Gαq サブユニットに関連する PLC-β の制御に起因します。イノシトール三リン酸(IP3) の代用として、D-myo-イノシトール一リン酸(IP1)などの重要なメディエーターを測定することができます。Gαq と結合した GPCR は、PLC-β の活性を刺激し、その結果、細胞内の IP1 が増加します。

cAMP は、最も重要な GPCR の細胞内メディエーターの一つであり、多くの場合、ヘテロ三量体 G タンパク質の Gα サブユニットによるアデニル酸シクラーゼ(AC)の制御に起因します。 Gαs 結合型 GPCR は、AC の活性を刺激し、細胞内 cAMP の増加をもたらす。Gαi 結合型 GPCR は、AC を負に制御し、cAMP の産生を減少させます。


G-Protein Signaling – Gs, Gi, and GQ are types of G-protein α subunits.

 

Guides: Optimizing Gs and Gi Agonist and Antagonist Assays

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Guides: Master IP-One Assays

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White Paper: IP-One

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White Paper: GPCR Second Messenger Data

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Activation of GPCR leads to GDP/GTP nucleotide exchange on the Gα protein subunit and binding of the Eu-GTP analog. Detection is enabled by the addition of the d2 anti-Gi antibody. An antagonist addition competes with the agonist binding in the orthosteric site of GPCR and inactivates the G protein.
Eu-GTP dissociates, leading to FRET signal extinction.

GTPγS – GTP Binding Assay

グアニン5′(三水素二リン酸)(GTPγS)は、GTP の非加水分解性アナログであり、グアニンヌクレオチド結合タンパク質を刺激するなど、同様の生理的挙動を示します。

GTP 結合アッセイは、G タンパク質 α サブユニットへの GTP の結合を測定することにより、GPCR のアゴニスト占有後の G タンパク質活性化レベルを測定します。このアッセイによって、受容体が媒介する最初のイベントの一つである、受容体占有機能をファンクショナルに測定します。

このシンプルなアッセイにより、シグナル伝達における各々のタンパク質の役割、GPCR-受容体の構成的活性変化、アゴニスト特異的シグナル伝達など、現代の薬理学上の課題をより深く理解することができます。

Guides: Optimize GTP Binding Assays

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Application Note: Identification and Characterization of GPCR Compoundss

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Application Note: Upstream and Downstream GPCR Readouts

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Application Note: Pharmacological Validation of a Panel of GPCRs

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β-arrestin pathway, and arrestins binding clathrin and its adaptor AP2 – key components of the internalization of GPCR machinery

β-Arrestin Signaling

アレスチンは、GPCR のシグナル伝達を制御するタンパク質ファミリーです。
β-アレスチンは、GPCR の脱感作、内在化と隔離、トラフィッキングなど、多くの生理的・病理的プロセスにおいて重要な役割を果たしています。

β-アレスリン1 と β-アレスリン2 は、GPCR の脱感作と内在化を媒介し、様々な組織や細胞に広く分布しています。両者ともに細胞質に集積しますが、β-アレスリン1は核にも集積します。

これらのタンパク質は、足場タンパク質として機能し、MAPK 伝達経路の特定のタンパク質や、ERK や AKT などの様々な GPCR の下流のターゲットと関連しています。

β-アレスリンは、広範囲のGタンパク質シグナルを阻害し、より直接的なシグナル伝達カスケードを活性化する能力があるため、通常のGPCRを標的とした薬剤よりも副作用の影響を受けにくい治療法を開発することが可能と言われています。


β-arrestin-regulated internalization of GPCR

(1) Biased ligands open the internal segment of GPCR to phosphorylation. (2) β-arrestin is recruited in place of G proteins. (3) β-Arrestin recruit AP2 (adaptor complex) which acts as a linker for clathrin to the GPCR. (4) Clathrin and dynamin networks coat and define an internalization area around the GPCR. (5) The GPCR is internalized and the internalization complexes disassemble.

 

Technical Note: Key Success Tips to Performing B-Arr2 Recruitment Assays

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Application Note: Inducing β-Arrestin 2 Recruitment

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Application Note: Tools for β-Arrestin Monitoring in Various Cells

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eBook: Exploring the Roles of β-Arrestins and Their Therapeutic Potential in GPCR Signaling

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Receptor Binding

Tag-lite assay principle

非放射性 Tag-lite バインディングアッセイは、化合物の化学構造や薬理特性に関わらず、化合物の結合特性を評価するための簡単な「まぜるだけ」の手法です。

18 種類の Tag-lite バインディングアッセイがバリデーションされており、カスタムアッセイ構築・開発サービスもパーキンエルマーでは提供いたします。

Kd を測定するには、蛍光リガンドを一定数の標識細胞を含む溶液に滴定し、平衡状態になるまでインキュベートします。Ki を測定するには、化合物を一定濃度の蛍光リガンドと一定量の細胞を含む溶液に滴定します。平衡状態では、受容体に結合した標識リガンドの割合は、記録された FRET シグナルに比例します。結合親和性は、この結果得られたシグナルから計算されます。

Application Note: Determination of Kon and Koff Rate Constants with Tag-Lite

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Poster: Multidimensional Assays for GPCRs

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Flyer: Tag-lite Binding Assay

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Phosphorylation Pathways

GPCRs are at the head of many phosphorylation cascades resulting from phosphatases bound to their second messengers

GPCR が活性化されると、まず G タンパク質を介してシグナルが伝達され、次にセカンドメッセンジャーが伝達される。そのシグナル伝達の第3 の部分には、転写因子や遺伝子発現の変化につながるリン酸化タンパク質パスウェイが関与しています。

すべての GPCR はそれぞれ特異的なシグナル伝達パスウェイを持ちますが、リン酸化酵素はそのパスウェイに常に関与しており、核に至るまでのリン酸化カスケードのトリガーやプロモーターの役割を果たしています。MA キナーゼパスウェイは 3種類の GPCR に共通しており、結果として、細胞の生存、増殖、分化、代謝における、GPCR の活動をモニタリングすることができます。

Guide: Cell Signaling Experiments

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Application Note: GPCR-Mediated ERK1/2 Phosphorylation

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GPCR Reagents

パーキンエルマーのアッセイは、GPCR の活性化経路全体に対応、すなわち、リガンド結合とシグナル伝達のすべてのカテゴリーをカバーしており、GPCR 研究をサポートします。パーキンエルマーのキットは、HTRFAlphaLISA などの複数のアッセイ技術にて提供されており、研究者の創薬研究ワークフローに簡単に組み込むことができる迅速で正確な方法です。

GPCR Reagents Portfolio

PHOSPHORYLATION ASSAYS
TECHNOLOGY
AKT Total HTRF
AKT phospho S/T

HTRF

AKT phospho S473
HTRF, ASSF
AKT phospho T308
HTRF, MPSU, DELFIA®, LANCE®
AKT/PKB
LANCE Ultra
AKT1 total
HTRF, ALSU, ASSF, LANCE Ultra, LANCE
AKT1 phospho S308
ALSU, LANCE, LANCE Ultra
AKT1 phospho S473
HTRF, ALSU, ASSF, LANCE Ultra
AKT1 phospho T308
ASSF, LANCE Ultra
AKT2 total
HTRF
AKT2 phospho S473
HTRF
AKT3 total
HTRF
AKT3 phospho S473
HTRF
AKT1/2/3 total
ALSU, MPSU, ASSF
AKT1/2/3 phospho S473
ALSU, LANCE Ultra, LANCE
AKT1/2/3 phospho T308
ALSU, TBSU, ASSF, LANCE Ultra
AKT1/2/3 phospho S473 and AKT1 total
MPSU
AKT1/2/3 phospho S473 and ERK 1/2 phospho T202/Y204
MPSU
AMPK total
HTRF
AMPK phospho T172
HTRF, ALSU, LANCE Ultra
AMPKa1/2
ALSU 
AMPKa phospho T172
ALSU, LANCE Ultra
AMPKa1/2 phospho T172 and total
MPSU
BAD phospho S112
HTRF, ASSF
BAD phospho S136
ASSF
CREB total
HTRF, ALSU, LANCE Ultra
CREB phospho S133
HTRF, ALSU, TBSU, ASSF, LANCE Ultra
ERK total
HTRF, ASSF, Alpha CETSA, MPSU
ERK phospho T202/Y204
HTRF, ALSU, TBSU, ASSF, LANCE Ultra
ERK1/2 total
ALSU, MPSU, LANCE Ultra, LANCE
ERK1/2 phospho Y204
ALSU, LANCE Ultra, LANCE
MEK1 total
HTRF, ALSU, Alpha CETSA
MEK1 phospho S218/222
HTRF, ALSU, TBSU, ASSF
MEK1 phospho S298
HTRF
MEK1 phospho S218/222 and total
MPSU
MEK1/2 phospho S217/221
HTRF, LANCE Ultra
MEK1/2 phospho S218/222
HTRF

 
TAG-LITE LABELED RECEPTORS AND LIGANDS
GPCR
Adenosine A1 Adenosine A1 receptor
Adenosine A2A
Adenosine A2A receptor
Adenosine A2B
Adenosine A2B receptor
Adenosine A3
Adenosine A3 receptor
Adrenergic beta-1
Adrenergic beta-1 receptor
Adrenergic beta-2
Adrenergic beta-2 receptor
Angiotensin AT2
Angiotensin AT2 receptor
Chemokine CXCR4
Chemokine CXCR4 receptor
Dopamine D2
Dopamine D2 receptor
Glucagon GIPR
Glucagon GIPR receptor
Glucagon GLP1
Glucagon GLP1 receptor
Orexin OX2
Orexin OX2 receptor
Serotonin 5HT1A
Serotonin 5HT1A receptor
Serotonin 5HT4
Serotonin 5HT4 receptor
Vasopressin V2
Vasopressin V2 receptor
Delta-opioid
Delta-opioid receptor
Kappa-opioid
Kappa-opioid receptor
Mu-opioid
Mu-opioid receptor
GTP BINDING ASSAY KITS
TECHNOLOGY
GTP / Gi protein binding
HTRF
SECOND MESSENGER ASSAYS
TECHNOLOGY
cAMP
AlphaScreen, HTRF, AlphaLISA, LANCE Ultra, LANCE
IP-One
HTRF, AlphaLISA
β-ARRESTIN ASSAY KITS
TECHNOLOGY
β-arrestin 2 recruitment
HTRF
β-arrestin 1 total
HTRF
β-arrestin 2 total
HTRF
AP2 total
HTRF

ALSU = AlphaLISA SureFire Ultra; ASSF = AlphaScreen SureFire; MPSU = Alpha SureFire Ultra Multiplex; TBSU = Terbium SureFire Ultra


EXPLORE ALL ASSAYS

 

GPCR Cell Lines and Membrane Preparations

リガンド結合アッセイやファンクショナルアッセイ用の、400以上の安定発現細胞株、100以上の膜画分調製物、これらの製品は、パーキンエルマーのGPCRポートフォリオの中でも最大のものの1つです。

Membrane Preparations

組換えまたは内因性 GPCR を発現する細胞から調製した膜画分を用いて、目的の受容体に結合するリガンドを同定し、特性を明らかにします。

Target include:

  • Adenosine
  • Adrenergic
  • Cannabinoid
  • Dopamine
  • GABA
  • Melanocortin
  • Muscarinic
  • Opioid
  • Serotonin
 

Stable Cell Lines

アッセイ開発にかかる時間を短縮し、結果の質を向上させるために、バリデーション済のGPCR安定化細胞株を用いて、結合アッセイやファンクショナルアッセイ、カルシウムアッセイを行うことができます。

Target include:

  • Adenosines
  • Adrenoceptors
  • Cannabinoids
  • Chemokines
  • Dopamine
  • Galanin
  • Histamines
  • Opioids
  • Muscarinic
 

Frozen Cells

スクリーニング、リード化合物の最適化、プロファイリングを効率的に行うために、安価かつ使い切りの細胞を用いて、一度に複数の受容体に対する細胞ベースのGPCRアッセイを実施可能です。

Target include:

  • Adrenergic
  • Anaphylatoxin
  • Chemokine
  • Histamine
  • Melanocortin
  • Muscarinic

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マルチモードプレートリーダー

EnSIght, Nivo, and EnVision Multimode Plate Readers

当社のマルチモードマイクロプレートリーダーは、吸光度、Alpha 発光 、蛍光強度、蛍光偏光、時間分解蛍光などの主要な検出を1台で実現します。また、EnSight マルチモードプレートリーダーは、高速のウェルイメージングが可能なため、ターゲットベースのスクリーニングや表現型のスクリーニングを行い、さまざまな視点から貴重な知見を得ることができます。当社のプレートリーダーはすべて自由な構成 が可能なので、必要に応じて測定技術を追加し、ラボの将来性を高めることができます。30年以上にわたる装置開発の経験を持つ 当社のマイクロプレートリーダーの 性能と信頼性にご期待ください。

eBook: Choosing the Right Plate Reader

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Infographic: Accelerating Drug Discovery

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Opera Phenix Plus High-Content Screening System

Operetta CLS High-Content Analysis System

ハイコンテンツイメージング

当社のハイコンテントイメージング装置は、2D および 3D の細胞モデルを用いて、明視野および蛍光で、シングルセルまたはウェルレベルでの GPCR ホメオスタシスシグナル伝達の変化を調べることができます。フラッグシップモデルの Opera Phenix Plus は、リキッドハンドリング機能を搭載しており、アゴニストやアンタゴニストの研究を含め、カルシウムフラックスを迅速に測定することができます。また、主力モデルの Operetta CLS は、リン酸化タンパク質や総タンパク質発現マーカーを用いて、受容体の内在化、β-アレスチンの局在化、その他のシグナル伝達経路を測定することができます。
表現型のスクリーニングアプローチが必要な場合は、当社のイメージングシステムを、細胞株、CRISPR 試薬PhenoVue セルペインティング試薬、Signals 情報ツールの包括的なポートフォリオと合わせてご利用ください。当社の MuviCyte ライブセルイメージャーは、長時間のタイムラプス イメージングのアプリケーションに最適です。

Application Note: Kinetic Calcium Flux Imaging with Opera Phenix Plus

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Application Note: Phenotypic Analysis of Hypertrophy in Human iPSC-Derived Cardiomyocytes

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Application Note: ERK Signal Transduction in Live Cells Using FRET/Operetta CLS HCA

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Application Note: Cell Painting for Phenotypic Screening

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