DELFIA

ランタノイド(Eu)キレート標識抗リン酸化部位特異的抗体を用いたアッセイ系です。通常ビオチン化したペプチド、あるいはタンパク質を評価するキナーゼとATPの存在下、リン酸化反応を行います。反応後、ペプチドをストレプトアビジンプレートに固定し、Eu標識抗リン酸化抗体を加え、リン酸化部位に結合させます。あるいは、リン酸化部位特異的抗体を結合させた後に、Eu標識二次抗体を結合させます。LANCEとは異なり、DELFIA Eu-キレート自体は蛍光を発しませんので、未反応のEu標識抗体を洗浄して取り除いた後、DELFIA Enhancerを加えることでEu標識抗体から放出されるEuが蛍光ミセルを作り、時間分解蛍光による測定が可能になります。
このようにヘテロジニアス系ですが、ダイナミックレンジが広く高感度なアッセイ系が構築できます。また、DELFAは高感度であるために、endogenousなタンパク質の変化も検出することが可能です。更に、Eu以外のランタニドを標識に用いることにより、異なるタンパク質のリン酸化を同時に検出した報告があります。

プロトコール

• DELFIA Tyrosine Kinase kit

参考資料

• DELFIA プロテインキナーゼアッセイ
• DELFA Abl チロシンキナーゼアッセイ
• References for DELFIA Drug Screening

参考文献

Barrie SE, et al, (2003) High-throughput screening for the identification of small-molecule inhibitors of retinoblastoma protein phosphorylation in cells. Anal Biochem, 320, 66-74.