Alpha CETSA (細胞ベースのサーマルシフトアッセイ) - PerkinElmer Japan

Alpha CETSA (細胞ベースのサーマルシフトアッセイ)

Cellular Thermal Shift Assay (CETSA)は、細胞と化合物をヒートショック処理し、化合物結合による標的タンパク質の熱安定性変化を測定することで、ターゲットエンゲージメントを数値評価する手法です。
Pelago BioScience 社により構築されたこの CESTA と、PerkinElmer の高感度な Alpha (またはHTRF) を組み合わせることによって、Pelago BioScience 社が唯一ハイスループットな ‘Real CETSA’ と認めた、組換え細胞ではなく、内在性のタンパク質を評価した Alpha CETSA が開発されました。
ドラックディスカバリープロセスの早い段階で、真のターゲットエンゲージメントアッセイをハイスループットで行うことができます。さらに、初代培養細胞の利用や臨床検体への応用も可能なため、一度アッセイ系を構築すればシームレスに化合物評価することができます。

How CETSA works

CETSA では、テスト化合物とインタクト細胞を反応後、サーマルサイクラーを用いてヒートショック処理します。化合物が標的タンパク質に結合すると、熱安定性が変化し、メルトカーブのシフトが得られます。安定性の変化が得られた温度における、ドーズレスポンス等の化合物評価を実施します。
生細胞の代わりに、細胞ライセートを用いる方法もあります。これは化合物の細胞膜透過性や排出、代謝に依存せず、ターゲットエンゲージメント評価に利用できます。
Alpha CETSA では、標的と結合する抗体を用いて検出を行います。ビオチン化抗ターゲット抗体はストレプトアビジンドナービーズに結合、もう一方の抗体は AlphaLISA アクセプタービーズに結合しています。
標的タンパク質の立体構造が維持されていれば各抗体が結合し、ドナービーズとアクセプタービーズは近接します。この状態で励起光(680 nm)を照射すると、ドナービーズによって産生された一重項酸素は溶液内を拡散、近接した AlphaLISA アクセプタービーズと反応し発光シグナル(615 nm)が検出されます。
一方、ヒートショックにより標的タンパク質が変性してしまうと抗体は結合することができません。ドナービーズとアクセプタービーズは近接しないため、励起光(680nm)を照射しても一重項酸素はアクセプタービーズに届かず、シグナルは得られません。

 

Alpha CETSAの特長

  • 細胞ベースの真のターゲットエンゲージメントアッセイ
  • 内在性タンパク質を用いた physiologically relevant モデル (タグ不要)
  • アッセイ構築において細胞を組み替える必要なし (クローニング不要)
  • Alpha テクノロジーの利用により、高感度で迅速なホモジニアスアッセイを実現(洗浄・分離操作不要)
  • Pelago Bioscience 社により評価された信頼性の高いプロトコール
  • 最適化された細胞溶解液(5種類から選択)
  • 合理的なワークフロー。最低限の操作で最速の結果を取得
  • 高い再現性により一貫性のある結果
  • 自動化への高い適合性

 

Alpha CETSA kit ワークフロー

 

Alpha CETSA kit アッセイ例

細胞内p38αの、各温度における検出量の変化(Apparent melting curve for intracellular p38α)

HL-60 細胞に化合物(ERK11e:ERK 阻害剤、SB203580/AMG-546:p38α阻害剤) および DMSO(negative control)を加えた後、ヒートショックを与え(3 分)、細胞を溶解後、a) ウエスタンブロッティング(左図 : 右画像データをグラフ化)または b)Alpha SureFire total p38α キットを用いて p38α を検出しました( 右図)。ヒートショックを与えても、p38α 阻害剤が結合することによって p38α が安定化されていることが観察されます。

 

各化合物濃度における、熱安定化された細胞内p38α量の変化(Isothermal dose-response fingerprint for intracellular p38α)

HL-60 細胞にそれぞれの濃度の化合物(ERK11e:ERK 阻 害 剤、SB203580/AMG-546:p38α 阻害剤)を加えた後、上図で得られた温度のヒートショック(50°C)を与え(3分)、細胞を溶解後、a)ウエスタンブロッティン グ(左図 : 右画像データをグラフ化)または b) Alpha SureFire total p38α キットを用いて p38α を検出しました(右図)。化合物によって、p38α の熱安定性が異なっていることが観察されます。

 

Ref. Rozbeh Jafari. et al. The cellular thermal shift assay for evaluating drug target interactions in cells. Nature Protocols volume 9, pages2100–2122(2014)

 

Alpha CETSA kits ラインナップ

CETSA Full Validated Kits (Lysis Buffer込)

Alpha CETSA アッセイでは、使用する細胞によって適した lysis buffer が異なるため、lysis buffer の選択が非常に重要です。Full CETSA validated kits では、Pelago Bioscience 社によって推奨される、Alpha CETSA アッセイに適した CETSA Lysis Buffer 5種がキットに含まれます。

Target Target Class 500 points* 品番
Akt1 Kinase CETSA-AKT1-A500
BCL-2 Apoptosis checkpoint family
CETSA-BCL2-A500
CDK2 Kinase CETSA-CDK2-A500
CDK4 Kinase CETSA-CDK4-A500
EGFR Receptor Tyr Kinase CETSA-EGFR-A500
ERK1/2 Kinase CETSA-ERK-A500
ErbB2 Receptor Tyr Kinase CETSA-ERBB2-A500
MEK1 Kinase CETSA-MEK1-A500
NFκB p65 Transcription intermediary factor CETSA-NFKB-A500
P38 Kinase CETSA-p38-A500
Raf-1 Kinase CETSA-RAF1-A500
STING Signal transduction adaptor CETSA-STING-A500
CRBN Ubiquitin E3 Ligase CETSA-CRBN-A500

内容:
a)BCL-2、CRBN 以外のキット

Activation Buffer, Reaction Buffer(ターゲット認識抗体を含む), Dilution Buffer, AlphaLISA CaptSure Acceptor Beads, Streptavidin Alpha Donor beads, Positive Control Lysate, CETSA Cell Lysis Buffer (5種)

b)BCL-2 、CRBN キット

CETSA Cell Lysis Buffer (5種), 抗ターゲット抗体標識 AlphaLISA Acceptor beads, Streptavidin Alpha Donor beads, ビオチン標識抗ターゲット抗体, analyte, AlphaLISA immunoassay buffer

数量:
1 points は、キット推奨量(20 μL/well)で使用した場合の 384 ウェルプレート 1 ウェル分に相当します。

保存:
+ 4℃ および control lysate のみ –20℃

*5,000ポイントも販売しております。詳細はお問い合わせください。

 

CETSAble Kits (Lysis Buffer別売)

CETSAble Kitsは、Pelago Bioscience社によって、CETSA Lysis buffer 3とTHP1またはU2OS細胞によってCETSAアッセイが可能と検証されたキットです。Alpha CETSAアッセイに必要なCETSA Lysis Bufferはキットに含まれず、別途ご購入が必要です。

Target Target Class Location 500 points* 品番
ACC Enzyme Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TACC-A500
Akt 1/2/3 Kinase
Nuclear ALSU-TAKT-B500
AMPKa 1/2
Kinase
Nuclear and Cytoplasmic ALSU-TAMPK-A500
BTK Kinase Plasma membrane and Cytoplasmic
ALSU-TBTK-A500
CHK2 Kinase Nuclear ALSU-TCHK2-A500
c-Myc Transcription factor Nuclear ALSU-TCMYC-A500
eIF2a Translation factor Cytoplasmic ALSU-TEIF2-A500
eIF4E Translation factor Nuclear and Cytoplasmic ALSU-TEIF4-A500
FGFR1 Receptor Tyr Kinase Nuclear and Cytoplasmic ALSU-TFGFR1-A500
FGFR2 Receptor Tyr Kinase Nuclear ALSU-TFGFR2-A500
IGF1R Receptor Tyr Kinase Plasma membrane ALSU-TIGFR-A500
Ikka Kinase Nuclear and Cytoplamic ALSU-TIKKA-A500
INSR Receptor Tyr Kinase Plasma membrane ALSU-TINR-A500
IRF3 Transcription factor
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TIRF3-A500
JNK 1/2
Kinase
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TJNK-A500
KAP1
Transcription factor
Nuclear
ALSU-TKAP1-A500
MKK4
Kinase
Nuclear
ALSU-TMKK4-A500
MLKL
Adaptor protein
Plasma membrane
ALSU-TMLKL-A500
mTor
Transcription factor
Cytoplasmic
ALSU-TMTOR-B500
NFKB p65
Nuclear factor
Nuclear and Cytoplasmic
CETSA-NFKB-A500
p53
Transcription factor
Nuclear
ALSU-TP53-A500
P70S6K
Kinase
Nuclear
ALSU-TP70-A500
PI3K p 85
Kinase
Cytoplasmic
ALSU-TP13K-A500
PLCG1
Kinase
Cytoplasmic
ALSU-TPLCG1-A500
PLCG2
Kinase
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TPLCG2-A500
Rb
Transcription factor
Nuclear
ALSU-TRB-A500
RET
Receptor Tyr Kinase
Plasma membrane and Cytoplasmic
ALSU-TRET-A500
RIPK1
Kinase
Plasma membrane and Cytoplasmic
ALSU-TRIPK1-A500
RPS6
Kinase
Cytoplasmic
ALSU-TS6R-A500
SHP1
Enzyme
Nuclear
ALSU-TSHP1-A500
SHP2
Enzyme
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TSHP2-A500
SLP76
Adaptor protein
Cytoplasmic
ALSU-TSLP-A500
SMAD1
Signal transducer and transcriptional modulators
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TSM1-A500
SMAD2
Signal transducer and transcriptional modulators
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TSM2-A500
SMAD3
Signal transducer and transcriptional modulators
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TSM3-A500
STAT1
Signal transducer and transcription activator
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TST1-A500
STAT3
Signal transducer and transcription activator
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TST3-A500
STAT5
Signal transducer and transcription activator
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TST5-A500
STAT6
Signal transducer and transcription activator
Nuclear and Cytoplasmic
ALSU-TST6-A500
SYK
Kinase
Plasma membrane and Cytoplasmic
ALSU-TSYK-A500
TBK1
Kinase
Nuclear
ALSU-TTBK1-A500

内容:
Activation Buffer, Reaction Buffer(ターゲット認識抗体を含む), Dilution Buffer, AlphaLISA CaptSure Acceptor Beads, Streptavidin Alpha Donor beads, Positive Control Lysate.

数量:
1 points は、キット推奨量(20 μL/well)で使用した場合の 384 ウェルプレート 1 ウェル分に相当します。

保存:
+ 4℃ および control lysate のみ –20℃

*10,000、50,000 ポイントもポイントも販売しております。詳細はお問い合わせください。

 

CETSA Lysis Buffer
製品名 数量 品番
CETSA Lysis Buffer 1 (5x) 10 mL CUSJPCETSALB1
CETSA Lysis Buffer 2 (5x) 10 mL CUSJPCETSALB2
CETSA Lysis Buffer 3 (5x) 10 mL CUSJPCETSALB3
CETSA Lysis Buffer 4 (5x) 10 mL CUSJPCETSALB4
CETSA Lysis Buffer 5 (5x) 10 mL CUSJPCETSALB5

保存:+4℃

 

 

※注意

CETSA® は、Pelago BioScience 社によって開発された特許を有するアッセイ手法です 。Alpha CETSAアッセイを行うには、使用料が発生いたします。詳細は弊社までお問い合わせ下さい