Iminobiotin Protein Labeling Kit　修飾ビオチンによるタンパク質標識・蛍光検出キット

2-イミノビオチンは pH に依存してアビジン・ストレプトアビジンに対するアフィニティーが変化し、アルカリ条件化では高く (Ka=108 M-1) 、酸性条件下では低下します。また、イミノビオチン化されたタンパク質の分子量は 225Da増えますが、 pH3.0 - 9.5のレンジでは等電点は変化しません。この性質を利用してイミノビオチン標識したタンパク質だけをSDS-PAGEや2D-PAGE後に可逆的に染色するキットです。

典型的な実験の流れ（細胞膜タンパク質標識の場合）
典型的な実験の流れ（細胞膜タンパク質標識の場合）


pH の変化に伴う 2- イミノビオチンの構造変化
pH の変化に伴う 2- イミノビオチンの構造変化 pHが高い状態では遊離塩基となりアビジンに対し高いアフィニティーを持ちます。低pHでは塩を形成しアフィニティーが低下します。

細胞画分のイミノビオチン標識タンパク質のEmber Biotin Binder Dye染色と全染色の比較
細胞画分のイミノビオチン標識タンパク質のEmber Biotin Binder Dye染色と全染色の比較 A431およびHEK293細胞を1時間イミノビオチン標識し、細胞分画を抽出しSDS-PAGEを行った。ゲルAは、Ember Biotin Binder Dye染色、ゲルBはSYPRO Rubyによる全タンパク質染色。細胞骨格フラクションは、hot SDSに溶解前にDNase, RNase処理を行った。
  1. ビオチン化分子量マーカー, 200ng (NEL310)
  2. 細胞質フラクション（未処理）
  3. 細胞質フラクション、イミノビオチン標識
  4. 細胞膜フラクション(未処理)
  5. 細胞膜フラクション、イミノビオチン標識
  6. 細胞骨格フラクション、イミノビオチン標識
  7. イミノビオチン標識BSA(69kDa)とOvalbumin (46kDa)(キットに含まれるコントロール)

Ember biotin binder dyeの蛍光スペクトラム
Ember biotin binder dyeの蛍光スペクトラム Ember biotin binder dyeは、イミノビオチン化BSAを用いた検出で1ngの検出感度と、500ngまでの感度直線性が得られています。

イミノビオチン標識BSAを泳動したSDS-PAGEをEmber biotin binder dyeにより染色した。

同じゲルを脱染色し、観察した。

キットには、タンパク質中のリジン残基のε-アミノ基と反応するNHS-イミノビオチン、可逆的にイミノビオチンと結合する蛍光ゲル染色試薬(Ember Biotin Binder Dye)および、必要なバッファー類を含みます。

製品 製品コード
Iminobiotin Protein Labeling Kit RPD100A001KT
内容
NHS-Iminobiotin 10 x 1.8 mg
Ember Biotin Binder Dye 2.5 mL
Gel staining buffer (20x ) 50 mL
Gel De-staining solution A (5x ) 100 mL
Gel De-staining solution B (100x ) 5 mL
Positive control  
Negative control  

※保存は 2-8℃です。

References

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