Phos-trap 質量分析用リン酸化ペプチド濃縮キット
質量分析のためにリン酸化ペプチドを濃縮する方法としてFe3+, Ga3+などの三価の陽イオンを固相化したIMAC (Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography)が良く使われていますが、リン酸化ペプチドだけでなく酸性アミノ酸の連続したペプチドも濃縮してしまうことがあります。
Phos-trapは酸性条件化でリン酸化合物が酸化チタン(TiO2)に結合することを利用しており、ペプチド濃縮用に結合特異性を高めるなど、各バッファーを最適化してあります。遠心し脂質層や不溶物を除いた5-50 μLの血清・血漿や0.1 - 1 nmoleのゲル内消化サンプルから簡便に再現性良くリン酸化ペプチドを濃縮できます。酸化チタン被膜磁気ビーズを用いたバッチ処理ですので、リキッドハンドリングシステムを使った自動化も96-wellフォーマットで可能です。また、Phos-trap24では1.5mｌ微量遠心チューブを使った濃縮が行えます。
濃縮されたリン酸化ペプチドを含む溶出バッファーは、直接 MALDI マトリックスと混合できます。ただし、 ESI-LCMS/MS の場合は、 ZipTipC18 によるクリーンアップが必要です。
| Phos-trap 96 の操作手順 |
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■Phos-trap 96 Phosphopeptide Enrichment Kit（製品コード：PRT301001KT）内容
| 20x Phos-trap Magnetic Beads | 1 mL |  |
| Binding Buffer | 100 mL | |
| Washing Buffer | 25 mL | |
| Elution Buffer | 3 mL | |
| 96-well V-Bottom Polypropylene Plate | 2 plates | |
| 96-well Plate Cover | 2 lids |
■専用マグネットプレート
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5083175 Separation Magnet Plate |
Phos-trap™
リン酸化ペプチド濃縮キット
■Phos-trap 24 Phosphopeptide Enrichment Kit（製品コード：PRT302001KT）内容
| 20x Phos-trap Magnetic Beads | 0.25 mL |
| Binding Buffer | 100 mL |
| Washing Buffer | 25 mL |
| Elution Buffer | 3 mL |
| Separation Magnet Ring (Separation Margnet Plate の磁石リング部分だけのものです） |
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References
- Pinkse, M. W. H.. et al. Selective Isolation at the Femtomole Level of Phosphopeptides from Proteolytic Digests Using 2D-NanoLC-ESI-MS/MS and Titanium Oxide Precolumns. Anal. Chem.; (Article); 76(14); 3935-3943 (2004).
DOI: 10.1021/ac0498617 - Larsen, M. R. et al. Highly Selective Enrichment of Phosphorylated Peptides from Peptide Mixtures Using Titanium Dioxide Microcolumns, Molecular & Cellular Proteomics 4:873-886 (2005).
- Thingholm, T.E. et al. Highly Selective Enrichment of Phosphorylated Peptide Using Titanium Dioxide, Nature Protocols, 1:1929-1935(2006)
DOI: 10.1038/nprot.2006.185 - Lyons, T. R. et al, Regulation of the pro-apoptotic scaffolding protein POSH by Akt, J. Biol. Chem, 282(30):21987-21997（2007）
DOI:10.1074/jbc.M704321200 - Lyons, T.R., et al. Regulation of the Pro-apoptotic Scaffolding Protein POSH by Akt. J. Biol. Chem. 282: 21987 – 21997 (2007).
- Kirkland, P. A. et al, Genetic and Proteomic Analyses of a Proteasome-Activating Nucleotidase A Mutant of the Haloarchaeon Haloferax volcanii. J. Bacteriol. 190: 193 – 205 (2008).
- Chi, Y. et al. Requirements for Protein Phosphorylation and the Kinase Activity of Polo-like Kinase 1 (Plk1) for the Kinetochore Function of Mitotic Arrest Deficiency Protein 1 (Mad1). J. Biol. Chem. 283: 35834-35844 (2008).
doi:10.1074/jbc.M804967200