Alpha Cellular Kinase Assay Kit - PerkinElmer Japan

Alpha Cellular Kinase Assay Kit

今日のキナーゼを標的とする創薬研究において、細胞ベースのアッセイは、生物学的有効性を証明するために必要不可欠となっています。キナーゼの生理学的な機能は、局在やアダプタータンパク質の存在、宿主細胞が制御するタンパク質など、細胞内の多くの因子に依存します。これらはシミュレートすることが難しく、精製キナーゼの活性阻害剤は同定可能であっても、細胞にその化合物が作用し得るかどうかは別の課題となります。細胞をベースとしたアッセイでは、初期スクリーニングにおいて同定された化合物が、細胞内に浸透可能か、あるいは副作用を引き起こすような細胞毒性を示さないかを特定することが可能となります。

パーキンエルマーの提供するAlpha SureFireは、洗浄操作なしに、細胞ベースでキナーゼ活性を検出可能なアッセイシステムです。


Alpha SureFire アッセイの模式図
細胞に刺激を与えて一定時間経過してから溶解し、細胞溶解液中のリン酸化タンパク質を
Donor ビーズと Acceptor ビーズそれぞれに結合した抗体でサンドイッチして検出します。

 

特長と利点
  • ホモジニアスなセルベースアッセイ : 洗浄やフィルトレーション操作が不要で、ミニチュア化が可能なマイクロプレートフォーマットのセルベースアッセイです。
  • 内因性発現レセプターでアッセイが可能 : ターゲットを過剰発現した細胞はもちろんのこと、生理学的に適切な内因性発現レベルの細胞でもアッセイが可能です。
  • 初代培養細胞でもアッセイが可能 : 多様な細胞種、アッセイフォーマットに対応します。
  • 自動化可能 : ハイスループットスクリーニングで実績のある Alpha テクノロジーです。優れた S/B 比、 Z' 値で 384 ウェル、 1536 ウェルフォーマットでのアッセイが可能です。

 

AlphaLISA SureFire Ultra と AlphaScreen SureFire

Alpha SureFireには、AlphaScreen SureFireと、よりダイナミックレンジが広く、且つ添加抗体の干渉を受け難いAlphaLISA SureFire Ultraの2種類があります。

特に、組織溶解液サンプルの使用、または抗体医薬品候補分子のスクリーニング・機能解析での利用には、AlphaLISA SureFire Ultraをご選択ください。


AlphaLISA SureFire Ultra Technology   AlphaScreen SureFire Technology
 
ビオチン化抗体(#1)およびCaptSure™リガンド標識された抗体(#2)が細胞溶解液中のリン酸化タンパク質を認識します。ストレプトアビジンドナービーズとCaptSure™ AlphaLISA アクセプタービーズが各抗体と結合して近接し、励起光照射(680nm)によりAlphaLISAシグナルが(615nm)検出されます。   ビオチン化抗体(#1)および未標識抗体(#2)が細胞溶解液中のリン酸化タンパク質を認識します。ストレプトアビジンドナービーズとProtein A AlphaScreenアクセプタービーズが各抗体と結合して近接し、励起光照射(680nm)によりAlphaScreenシグナル(520-620nm)が検出されます。

 

AlphaLISA SureFire Ultraの特長
  • 高感度で広いダイナミックレンジ
    発現レベルの低いリン酸化タンパク質も検出できます。
  • 抗体医薬品開発での利用が可能
    アクセプタービーズには、従来のAlphaScreen SureFireで使用していたProtein Aに代わり、CaptSure™を標識しています。細胞刺激に抗体を使用する際、その添加抗体がProtein Aに結合しアッセイに干渉する問題を回避しました。抗体のファンクショナルスクリーニングや機能解析など、適用できるアプリケーションがさらに広がりました。
  • 組織溶解液サンプルに対応
    ヘモグロビンの影響を受け難いAlphaLISAビーズを使用、また、従来のAlphaScreen SureFireで使用していたProtein Aに代わりCaptSure™を使用したことで、組織サンプル中のIgGの影響も回避されます。
  • 操作性
    384 wellプレートアッセイにおけるアッセイ量を増加、ピペッティング操作がより容易になりました。
  • アッセイ時間の短縮
    細胞溶解液に抗体およびビーズを添加後の反応時間は2時間と、アッセイ時間がより短くなりました。

 

SureFire UltraSureFireの比較

  用途 パフォーマンス
  サンプルの種類 細胞刺激
(添加物質)
感度 S/B IgGの干渉
AlphaLISA
SureFire Ultra
培養細胞
組織溶解液
低分子化合物
抗体分子
高感度 高い なし
AlphaScreen
SureFire
培養細胞 低分子化合物 中程度 中程度 あり
アッセイレンジの比較
  IgGが混在するサンプルにおける比較
MCF7 細胞(40,000 cells/well)を一晩培養した後、無血清培地中で2h 培養しました。その後、insulin で30 min 刺激した後、細胞を溶解し、AKT(S473) のリン酸化を SureFire およびSureFire Ultra アッセイキットで検出しました。SureFire Ultra の方が高感度で高い S/B 比を示しています。    EGF で刺激した A431 細胞の溶解液に rabbit IgG(10 μg/mL)を添加した後、細胞溶解液を段階希釈、ERK(T202/204)のリン酸化を SureFire およびSureFire Ultra アッセイキットにて検出しました。SureFire ではシグナルの低下が観察されましたが、SureFire Ultra はシグナルに変化はなく、混在する。

 

Alpha SureFire Ultra マルチプレックス(2波長検出) 

Alpha SureFire Ultraマルチプレックスアッセイキットは、波長の異なる2種類のAlphaアクセプタービーズ、Alpha 615(Eu)とAlpha 545(Tb)を利用し、細胞溶解液中の内在性リン酸化タンパク質とトータルタンパク質を同時に検出するアッセイキットです。

*測定には、AlphaScreenスタンダードオプションが搭載されたEnVisionと、対応するフィルターおよびミラーが必要です。

細胞溶解液中の標的タンパク質に、CaptSureタグ標識抗体とAlphaPlex 545 アクセプターが結合、またそのリン酸化部位に抗リン酸化抗体AlphaLISAアクセプタービーズが結合します。さらに、標的タンパク質に対するビオチン化抗体とストレプトアビジンドナービーズが結合します。
励起光照射(680 nm)により、AlphaLISAアクセプタービーズ(615 nm)とAlphaPlex 545 アクセプタービーズ(545 nm)が同時に発光、シグナルが検出されます。

 

 

 

 

 


リン酸化ERKとTotal ERKの同時検出
 
リン酸化AKTとTotal AKTの同時検出
A431細胞をプレートに播種(40,000 cells/well in MEM+10 %FCS) し、一晩培養した。2 時間の血清飢餓処理後、EGFで10 分刺激した。SureFire Ultra Lysis buffer 100 µL/well を添加し細胞を溶解、その細胞溶解液のうち10 µLを用いて、SureFire Ultra MultiPlexアッセイを実施、p-ERKとTotal ERKを同時検出した。
MCF-7 細胞をプレートに播種(40,000 cells/well in MEM+10 %FCS) し、一晩培養した。Wortmannin(in MEM+1 %FBS)にて2 時間刺激した後、2.5 µg/mLのインスリンで30 分刺激した。SureFire Ultra Lysis buffer 100 µL/well を添加し細胞を溶解、その細胞溶解液のうち10 µLを用いて、SureFire Ultra MultiPlexアッセイを実施、 p-AKTとTotal AKTを同時検出した。

 

Alpha SureFire Assay kit

MAPKシグナリング

IP3K-Akt シグナリング

mTORシグナリング/翻訳調節

NF-κBシグナリング

TGFβ/Smadシグナリング

JAK-STATシグナリング

ATM/ATR シグナリング

Wnt シグナリング

受容体型チロシンキナーゼ

その他