GTPバインディングアッセイ | Gタンパク質共役型レセプター - PerkinElmer Japan

GTP バインディングアッセイ

アゴニスト結合により GPCR が活性化すると、そのレセプターに共役した G タンパク質 α サブユニットで、 GDP-GTP 変換が起こります。この変換の度合いを評価するのが GTP バインディングアッセイで、非分解型の標識 GTP アナログが G タンパク質に結合する量を測定することによって行います。

  SPA
シンチレーション
ビーズ
FlashPlate SPA
イメージング
ビーズ
[35S]GTPγS
フィルトレーション
アッセイ
サンプル 受容体を発現する細胞膜
Mix & Measure Yes No
プレートフォーマット 96-/ 384-well UniFilter-96 GF/B§
(あるいはバイアル)
測定装置 MicroBeta2, TopCount ViewLux MicroBeta2,
TopCount
(Tri-Carb)
スループット
(8時間の処理ウェル数)
 > 20,000  > 20,000  > 50,000  > 15,000

§ ガラスファイバーフィルターのPEI処理は、[35S]GTPγSバインディングでは非特異的結合を上げますので行わないでください。

 

SPAビーズを用いたホモジニアス [35S]GTPγS バインディングアッセイ

近接する放射性核種のベータ線を受けて発光するSPAビーズには、青色光を発する"SPA シンチレーションビーズ"と、スクリーニング作業において黄色から茶色に着色している化合物のクエンチングを回避するため、赤色光を発する"SPA イメージングビーズ"の二種類が在ります。WGA コーティングしたSPA ビーズで糖鎖を含む受容体膜画分をキャプチャーするか、抗Gタンパク質抗体と二次抗体をコーティングしたSAP ビーズでキャプチャーすることにより、G タンパク質に [35S]GTPγS が結合したときに生じるシグナルを測定します。GPCR発現細胞を作製していたEuroScreenではGTPγ S バインディングアッセイには、もっぱらWGA-SAP ビーズを用いていました。

 

FlashPlate を用いたホモジニアス [35S]GTPγS バインディングアッセイ

FlashPlate は 96 あるいは 384 ウェルフォーマットの SPA マイクロプレートです。各ウェルは薄層のプラスティックシンチラントでコーティングされており、液体シンチレーションカクテルを加えることなく放射性核種の検出が可能です。 一般にGTP バインディングアッセイではプレート表面を WGA でコーティングしたものを用います。 WGA を介してプレート上結合した細胞膜画分に含まれる G タンパク質に [35S]GTPγS が結合したときに生じるシグナルを測定します。